FluorCam臺(tái)式植物多光譜熒光成像系統(tǒng)

FluorCam臺(tái)式植物多光譜熒光成像系統(tǒng)

——植物表型與生態(tài)實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用的儀器技術(shù)

PSI公司科學(xué)家Nedbal教授與公司總裁Trtilek博士等*將PAM葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)與CCD技術(shù)結(jié)合在一起，于1996年在世界上成功研制生產(chǎn)出FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（Heck等，1999；Nedbal等，2000；Govindjee and Nedbal, 2000）。FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)成為上世紀(jì)90年代葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的重要突破，使科學(xué)家們對(duì)光合作用與葉綠素?zé)晒獾难芯恳幌伦舆M(jìn)入二維世界和顯微世界。目前PSI公司已成為世界上、使用、種類面、發(fā)表論文多的葉綠素?zé)晒獬上駥I(yè)生產(chǎn)廠商

上左圖為上世紀(jì)90年代Nedbal等設(shè)計(jì)的FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)（Photosynthesis Research, 66: 3-12, 2000），右圖為檸檬彩色圖及葉綠素?zé)晒獬上駡D（Photosynthetica, 38: 571-579, 2000）

FluorCam臺(tái)式植物多光譜熒光成像系統(tǒng)是一款高度集成、高度創(chuàng)新、使用方便、應(yīng)用廣泛的植物活體成像技術(shù)設(shè)備，高靈敏度CCD鏡頭、4個(gè)固定的LED光源板及控制系統(tǒng)等集成于一個(gè)暗適應(yīng)操作箱內(nèi)（還可根據(jù)需求選配第五個(gè)光源板置于頂部），植物樣品放置在暗適應(yīng)操作箱內(nèi)的隔板上，隔板7級(jí)高度可調(diào)；光源由高穩(wěn)定性供電單元提供電源，4個(gè)高能、高穩(wěn)定性LED光源板均一性照在植物樣品上，成像面積可達(dá)13×13 cm；控制系統(tǒng)通過(guò)USB與計(jì)算機(jī)相聯(lián)，并通過(guò)FluorCam軟件程序控制和采集分析數(shù)據(jù)。適用于植物葉片及果實(shí)等其它植物組織、整株植物或培養(yǎng)的多株植物、苔蘚地衣等低等植物、藻類等，廣泛應(yīng)用于植物包括藻類光合生態(tài)、植物逆境脅迫與易感性、氣孔功能、植物環(huán)境如土壤重金屬污染響應(yīng)與生物檢測(cè)、植物抗性檢測(cè)與篩選、作物育種、Phenotyping等研究。

主要功能特點(diǎn):

· 系統(tǒng)集成于暗適應(yīng)操作箱內(nèi)，操作簡(jiǎn)便、便于移動(dòng)，既可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)也可在室外進(jìn)行暗適應(yīng)成像測(cè)量分析

· 高靈敏度CCD鏡頭，時(shí)間分辨率達(dá)50張每秒，快速捕捉葉綠素?zé)晒馑沧儯上衩娣e達(dá)13x13cm

· 是世界上可進(jìn)行OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)成像分析的葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)設(shè)備，可得到OJIP快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)態(tài)曲線及Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對(duì)關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）、QY、PI（Performance Index）等20多個(gè)參數(shù)

· 是世界上可進(jìn)行QA再氧化動(dòng)力學(xué)成像分析的葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)設(shè)備，可運(yùn)行單周轉(zhuǎn)飽和光閃（STF）葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)態(tài)，光強(qiáng)在100µs內(nèi)可達(dá)到120,000 µmol(photons)/m2.s

· 具備功能的、可編輯的葉綠素?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)程序（Protocols），包括快照模式、Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、2個(gè)葉綠素?zé)晒獯銣绶治觯∟PQ）protocolas（2套定制給光方案）、LC光響應(yīng)曲線、PAR吸收與NDVI成像分析、QA再氧化動(dòng)力學(xué)分析（選配）、OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)分析（選配）及GFP綠色熒光蛋白成像（選配）等

· 可進(jìn)行自動(dòng)重復(fù)成像測(cè)量分析，預(yù)設(shè)一個(gè)實(shí)驗(yàn)程序（Protocols）、測(cè)量次數(shù)及間隔，系統(tǒng)將自動(dòng)循環(huán)運(yùn)行成像測(cè)量，并自動(dòng)將數(shù)據(jù)按時(shí)間日期存入計(jì)算機(jī)（帶時(shí)間戳）；還可預(yù)設(shè)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)程序（Protocols）；比如使系統(tǒng)白天自動(dòng)運(yùn)行Fv/Fm，夜間自動(dòng)運(yùn)行NPQ分析等

· 具備雙色光化學(xué)光激發(fā)光源，標(biāo)準(zhǔn)配置為紅色和白色，可選配紅色與藍(lán)色等雙波段光化學(xué)光，雙色光化學(xué)光可按不同比例搭配使用，以便實(shí)驗(yàn)不同光質(zhì)對(duì)作物／植物的光合效益

左圖A為100％紅色光源條件下黃瓜葉片的Fv/Fm，左圖B為30%藍(lán)色光源條件下黃瓜葉片的Fv/Fm；右上圖為光合作用強(qiáng)度隨光照強(qiáng)度（不同比例藍(lán)色光）的關(guān)系，右下圖為氣孔導(dǎo)度隨光照強(qiáng)度（不同比例藍(lán)色光）的關(guān)系

· 可運(yùn)行葉綠素?zé)晒獬上?、多光譜熒光成像、GFP穩(wěn)態(tài)熒光成像

· 可選配TetraCam彩色成像模塊，大成像面積20x25cm，用于葉片或植物形態(tài)成像分析和葉綠素?zé)晒獬上駥?duì)比分析

· 可選配高光譜成像單元和紅外熱成像單元，植物性狀數(shù)字化、可視化，全面測(cè)量分析植物形態(tài)、光合效率、生化性狀、氣孔導(dǎo)度、脅迫與抗性等

· 可選配大型版移動(dòng)式植物成像分析系統(tǒng)，成像面積35x35cm，可運(yùn)行葉綠素?zé)晒獬上?、紅外熱成像及RGB成像分析

應(yīng)用案例：

Hendrik Kupper與Zuzana Benedikty等，在2019年2月出版的《Plant Physiology》，發(fā)表了Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging，該研究*采用超高速成像傳感器FluorCam臺(tái)式植物葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)與FKM多光譜顯微熒光成像系統(tǒng)，成像速度可達(dá)4000fps@640x512，QA再氧化葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)成像測(cè)量單脈沖飽和光閃達(dá)150,000 μmol/m2.s1。

附：OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)測(cè)定分析參數(shù)包括：

a) Fo：初始熒光或稱小熒光，50μs時(shí)的熒光

b) Fj：2ms時(shí)的熒光

c) Fi：60ms時(shí)的熒光

d) P或Fm：大熒光

e) Vj＝(Fj-Fo)/(Fm-Fo):j階熒光相對(duì)變量

f) Vi＝(Fi-Fo)/(Fm-Fo)：i階熒光相對(duì)變量

g) Mo＝TRo/RC-ETo/RC=4(F300-Fo)/(Fm-Fo)：熒光瞬變初始斜率，或稱OJIP曲線初始斜率

h) Area：OJIP曲線與Fm之間的面積，可稱為補(bǔ)償面積（complementary area）為了對(duì)不同樣品進(jìn)行比較，Area需要標(biāo)準(zhǔn)化為：Sm＝Area/(Fm-Fo)，Sm是對(duì)關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度

i) Fix Area：OJIP固定面積，OJIP曲線40微妙時(shí)的F值至1秒時(shí)的F值下面的面積

j) Sm：標(biāo)準(zhǔn)化OJIP補(bǔ)償面積，反映QA還原多次周轉(zhuǎn)

k) Ss＝Vj/Mo：標(biāo)準(zhǔn)化OJ相補(bǔ)償面積，反映單周轉(zhuǎn)QA還原

l) N=Sm/Ss=Sm Mo(1/Vj)：OJIP QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量（between 0 and t_Fm）

m) Phi---_Po＝QY＝φpo＝TRo/ABS＝Fv/Fm，大光量子產(chǎn)量，吸收光量子通量反應(yīng)中心初始捕獲比率

n) Psi_o＝ψo(hù)＝ETo/TRo＝1-Vj，捕獲光量子通量中電子傳遞光量子通量比率

o) Phi_Eo＝φ_Eo=ETo/ABS=(1-(Fo/Fm))(1-Vj)，吸收光量子通量中電子傳遞光量子通量比率，或稱電子傳遞光量子產(chǎn)量（quantum yield of electron transport at t=0）

p) Phi_Do＝φ_Do＝1-φpo＝Fo/Fm，能量散失光量子產(chǎn)量（t＝0）

q) Phi_pav＝φpav＝φpo（Sm/t_Fm），平均光量子產(chǎn)量，t_Fm為達(dá)到Fm所需時(shí)間（ms）

r) ABS/RC＝Mo(1/Vj)(1/QY)：為單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量，這兒的反應(yīng)中心僅指the active (QA to QA– reducing) centers（下同）。QY=TRo/ABS=Fv/Fm

s) TRo/RC＝Mo(1/Vj)：?jiǎn)挝环磻?yīng)中心初始（或稱大）捕獲光量子通量（導(dǎo)致QA的還原，也即反應(yīng)中心關(guān)閉比率B的增加）

t) ETo/RC＝Mo(1/Vj)（1-Vj）：?jiǎn)挝环磻?yīng)中心初始電子傳遞光量子通量

u) DIo/RC＝（ABS/RC）－（TRo/RC）：?jiǎn)挝环磻?yīng)中心能量散失

v) ABS/CS：?jiǎn)挝粯悠方孛娴奈展饬孔油浚?/span>CS stands for the excited cross-section of the tested sample（下同）。ABS/CSo＝Fo，ABS/CSm＝Fm，TRo/CSx＝QY(ABS/CSx)——單位截面捕獲能量或光量子通量

w) TRo/CSo＝QY.Fo；ETo/CSo＝φ_Eo.Fo ＝QY.(1-Vj).Fo

x) RC/CSx：反應(yīng)中心密度，RC / CS0 (active RCs per excited cross-section)

y) PI_ABS＝(RC/ABS)(φpo/φ_Do)(ψo(hù)/Vj)：基于吸收光量子通量的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)

z) PIcs＝(RC/CSx)(φpo/φ_Do)(ψo(hù)/Vj)：基于截面的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)